หลายคนอาจจะรู้จักคำว่า “PCR” ในบริบทของการตรวจ COVID-19 ในช่วงของการระบาดของไวรัส SARS-CoV-2 อันที่จริง เทคโนโลยีในการตรวจโควิดดังกล่าว เป็นประเภทย่อยของ PCR อีกทีที่เรียกว่า “Real-time RT-PCR” ที่ตั้งต้นมาจากการประยุกต์ใช้เทคโนโลยี PCR แบบย้อนกลับ เทคโนโลยี PCR ทำงานอย่างไร เหตุใดจึงเรียกได้ว่าเป็นเทคโนโลยีทองแห่งวงการชีววิทยา
PCR หมายถึง ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ย่อมาจาก “Polymerase Chain Reaction” เป็นปฏิกิริยาเลียนแบบปรากฏการณ์ที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิต อาศัยเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA Polymerase) ในการคัดลอกและสร้างดีเอ็นเอขึ้นมาใหม่จากแม่แบบเดิม
ในเซลล์ของร่างกายมนุษย์ทุกคนมี DNA Polymerase สำหรับใช้ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอระหว่างการแบ่งเซลล์ นอกจากนี้ยังพบ DNA Polymerase บางประเภทที่ใช้ซ่อมแซมดีเอ็นเอที่เสียหายอีกด้วย
ดีเอ็นเอส่วนใหญ่อยู่ในรูปแบบของ Double-stranded DNA หรือสารพันธุกรรมแบบเกลียวคู่ ซึ่งสารพันธุกรรมทั้งสองเส้นนี้เป็นแม่แบบของกันและกัน หากแท่งใดแท่งหนึ่งเสียหาย ก็สามารถซ่อมแซมโดยใช้อีกแท่งเป็นแม่แบบได้
PCR เป็นการนำ DNA Polymerase มาประยุกต์ใช้ในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมให้มีความเข้มข้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ หากจะเทียบให้เข้าใจได้ง่ายขึ้น จาก DNA เพียง 1 โมเลกุล เมื่อผ่านกระบวนการ PCR แล้วจะสามารถมีจำนวนเพิ่มขึ้นได้ถึง 1,000 ล้านโมเลกุล ทำให้นักวิทยาศาสตร์สามารถนำดีเอ็นเอจำนวนมากเหล่านี้ไปใช้ต่อได้ แม้จะตั้งต้นมาจากปริมาณเพียงน้อยนิด
แล้วเหตุใดนักวิทยาศาสตร์จึงจำเป็นต้องใช้ดีเอ็นเอหลักล้านหรือพันล้านโมเลกุล
เป็นเพราะว่าดีเอ็นนั้นมีขนาดเล็กมากจนไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าหรือแม้จะใช้กล้องจุลทรรศน์ก็ตาม ทำให้ต้องใช้เทคโนโลยีอื่นในการศึกษาโมเลกุลที่มีขนาดเล็กระดับนี้ ดังนั้น หากเรามีหลอดทดลองหนึ่งหลอด เราบอกว่ามีดีเอ็นเออยู่ในนั้น แต่เราไม่มีทางพิสูจน์ได้ว่ามีดีเอ็นเออยู่ในนั้นจริง ๆ เพราะว่ามันมีขนาดเล็กมาก หากเป็นเช่นนี้แล้วก็ยากที่เราจะทำการทดลองใด ๆ ต่อได้โดยใช้สมมติฐานว่ามีดีเอ็นเออยู่ในหลอดทดลองนั้น จึงต้องมีวิธีในการพิสูจน์ว่ามีดีเอ็นเออยู่ในนั้นจริง ๆ และหนึ่งในวิธีการพิสูจน์ก็คือกระบวนการ PCR
PCR อาศัยไพรเมอร์ (Primer) สั่งให้ DNA Polymerase จำลองชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการขึ้นมา ไพรเมอร์เป็นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่เราต้องการจะเพิ่มจำนวน มีอยู่สองชุด ประกบหัวและท้ายของ ดีเอ็นเอจึงมักเรียกว่าเป็นคู่ของไพรเมอร์ (Primer Pair)
ดีเอ็นเอประกอบไปด้วยสารเคมีที่ทำหน้าที่เข้ารหัส A T C และ G แท่งหนึ่งจะเป็นแท่งรหัสหลัก (Coding Strand หรือ CDS) บรรจุชุดรหัสพันธุกรรมที่เรียกว่ายีนเอาไว้ และอีกแท่งหนึ่งเป็นแท่งสำรอง (Non-coding Strand/Complementary Strand) สำหรับใช้ซ่อมแซมในกรณีที่แท่งรหัสหลักเสียหาย
รหัส A นั้นจะคู่กับรหัส T ส่วนรหัส C นั้นจะคู่กับรหัส G สำหรับการสร้าง DNA สองแท่งขึ้นมา ดังนั้นหากเรามีแท่งรหัสหลัก “AAA TTT CCC GGG” เราจะมีแท่งรหัสสำรอง “TTT AAA GGG CCC”
การที่เราจะจำลองดีเอ็นเอขึ้นมาใหม่ เราจะต้องมีแม่แบบ (Template) ซึ่งก็คือทั้งแท่งรหัสหลักและแท่งรหัสรอง จากนั้นเราจะต้องทำให้ DNA Polymerase รู้ว่าจะต้องเริ่มจำลองที่รหัสไหนและหยุดที่รหัสไหน วิธีหนึ่งก็คือการบอกโดยใช้ไพรเมอร์ ซึ่งก็คือการใช้เศษชิ้นส่วนดีเอ็นเอสายสั้น ๆ ให้ DNA Polymerase เริ่มต้นได้ ในกรณีนี้ เราสามารถใช้เศษดีเอ็นเอ “AAA” ในแท่งรหัสหลักและเศษดีเอ็นเอในส่วนของ “CCC” สำหรับแท่งรหัสสำรอง เท่านี้ DNA Polymerase ก็จะรู้ว่าต้องเริ่มที่ AAA ในแท่งรหัสหลัก และ CCC ในแท่งรหัสสำรองแล้ว โดยที่ DNA Polymerase จะค่อย ๆ เติมส่วนของ DNA ที่ขาดหายไปต่อจากไพรเมอร์ไปจนถึงจุดสิ้นสุดในทั้งสองแท่ง เท่านี้เราก็จะได้ดีเอ็นเอที่สองขึ้นมา
ความมหัศจรรย์ของ PCR อยู่ที่การทำซ้ำเรื่อย ๆ เพราะว่าในการทำซ้ำแต่ละรอบ เราจะมีดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า หากเรามีดีเอ็นเอหนึ่งโมเลกุลในตอนแรก หลังจาก PCR รอบแรก เราจะมีดีเอ็นเอสองโมเลกุล รอบต่อไปเราจะมี 4 โมเลกุล และหากทำซ้ำ 10 รอบ เราจะมีดีเอ็นเอ 1,024 โมเลกุล หากทำซ้ำอีก 10 รอบ เราจะมีดีเอ็นเอมากกว่า 100,000 โมเลกุล และหากทำซ้ำอีก 10 ครั้ง เราจะมีดีเอ็นเอมากกว่า 1 พันล้านโมเลกุล เราเรียกการทำซ้ำแบบนี้ว่า Cycle Threshold (Ct value)
เมื่อเราได้ดีเอ็นเอหลายล้านโมเลกุลแล้ว เราสามารถตรวจได้ว่าในหลอดทดลองของเรามีดีเอ็นเอที่เราต้องการอยู่จริง สำหรับการทำงานในห้องปฏิบัติการ ในสารดีเอ็นเอตัวอย่าง จะมีอยู่หลายรหัสปน ๆ กัน ทั้งรหัสที่เราอยากได้และไม่อยากได้ การใช้ไพรเมอร์ทำให้เราเลือกได้ว่าเราต้องการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอชิ้นไหน รหัสไหน ผลลัพธ์คือเราจะได้ดีเอ็นเอที่มีความเฉพาะเจาะจงต่อไพรเมอร์ที่เราเลือกสูงมาก นอกจากนี้ เพื่อการยืนยันเพิ่มเติม เราสามารถใช้เทคนิคการแยกดีเอ็นออกมาตามขนาดด้วยเจล (Gel Electrophoresis) เพื่อวัดมวลต่อความเข้มข้นของดีเอ็นเอได้ เนื่องจากเรารู้ขนาดของดีเอ็นเอที่เราต้องการอยู่ก่อนแล้ว เช่น มีรหัสอยู่ 1,000 คู่ ผลลัพธ์ที่เราได้หลังจาก PCR จะต้องมีความเข้มข้นของสารพันธุกรรมที่มีรหัสยาว 1,000 คู่สูงเช่นกัน ดังนั้นเราจะสามารถมั่นใจได้ว่าในหลอดทดลองของเรามีแต่สารพันธุกรรมที่เราต้องการ
ในเทคนิค Real-time RT-PCR มีชื่อเต็ม คือ “Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” ที่ใช้ในการตรวจหาไวรัส อย่าง COVID-19 นั้น เป็นการใช้หลักการเดียวกับ PCR แต่เพราะว่าไวรัส SARS-CoV-2 ซึ่งก่อให้เกิด COVID-19 นั้นมีสารพันธุกรรมที่อยู่ในรูปของอาร์เอ็นเอ (RNA) ทำให้เรียกว่าอยู่ในกลุ่ม RNA Virus
อาร์เอ็นเอเป็นอีกรูปแบบหนึ่งของสารพันธุกรรมนอกเหนือจากดีเอ็นเอ และในมนุษย์เราก็มีการใช้อาร์เอ็นเอเช่นกัน โดยทั่วไป DNA สามารถถูกแปลงเป็นอาร์เอ็นเอได้ ขณะเดียวกันอาร์เอ็นเอก็สามารถถูกแปลงกลับเป็นดีเอ็นเอได้ในไวรัสบางประเภท
อาร์เอ็นเอทำหน้าที่สำคัญมากมาย หนึ่งในนั้นคือการสังเคราะห์โปรตีน ดีเอ็นเอที่เข้ารหัสการสร้างโปรตีนไว้ จะต้องถูกนำมาถอดรหัสเป็นอาร์เอ็นเอเสียก่อน เรียกอาร์เอ็นเอประเภทนี้ว่า อาร์เอ็นเอส่งสาร (Messenger RNA หรือ mRNA) จากนั้นรหัสอาร์เอ็นเอจะมีถูกแปลงให้กลายเป็นลำดับกรดอะมิโนสำหรับสร้างโปรตีน
ในกรณีของ SARS-CoV-2 ซึ่งมีสารพันธุกรรมเป็นอาร์เอ็นเอเส้นเดี่ยว และมีการเข้ารหัสที่นำมาสร้างเป็นโปรตีนได้เลย มันจะขโมยทรัพยากรของเซลล์มาใช้เพิ่มจำนวนตัวมันได้โดยตรง
Real-time RT-PCR แท้จริงแล้วแบ่งเป็นสองส่วนคือ “RT” หรือ “Reverse Transcription” จากนั้นจึง “PCR” หรือ “Polymerase Chain Reaction” โดย RT คือการแปลงอาร์เอ็นเอของไวรัสให้กลับไปอยู่ในรูปของดีเอ็นเอโดยใช้เอนไซม์ที่เรียกว่ารีเวิร์สทรานสคริปเทส (Reverse Transcriptase) จากนั้นจึงใช้ PCR เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่แปลงกลับมาเพื่อตรวจหาสารพันธุกรรม ส่วนคำว่า Real-time นั้นเป็นวิธีในการตรวจวัดปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สนใจตลอดเวลาที่ทำ PCR
สาเหตุที่ไม่นิยมทำ PCR อาร์เอ็นเอแต่แรกนั้นเป็นเพราะว่า อาร์เอ็นเอมีความเสถียรต่ำ จึงควรแปลงกลับเป็นดีเอ็นเอก่อน นอกจากนี้ยังทำให้เราสามารถใช้ DNA Polymerase ซึ่งมีความแม่นยำและประสิทธิภาพสูงกว่ามาเพิ่มจำนวนได้นั่นเอง
เรียบเรียงโดย
โชติทิวัตถ์ จิตต์ประสงค์
Department of Biomedical Sciences
City University of Hong Kong
อัปเดตข้อมูลแวดวงวิทยาศาสตร์ เทคโนโลยี รู้ทันโลกไอที และโซเชียลฯ ในรูปแบบ Audio จาก AI เสียงผู้ประกาศของไทยพีบีเอส ได้ที่ Thai PBS
“รอบรู้ ดูกระแส ก้าวทันโลก” ไปกับ Thai PBS Sci & Tech
